D.Yu。Ryazantsev、E。M。Chudinova、L。Yu。Kokaeva、S。N。Elansky、P。N。Balabko、G。L。Belova、S。K。Zavriev
植物病原性真菌Colletotrichumcoccodesは、炭疽病および結核の黒い斑点として知られるジャガイモやトマトに危険な病気を引き起こします。 形態学的特徴により、他の微生物によって引き起こされる病気と区別するのは難しいことがよくあります。 緑のトマトの果実では、この病気は無症候性であり、熟した赤い果実にのみ現れます。 病原体を迅速かつ正確に診断するために、リアルタイムPCRテストシステムが提供されています。 試験システムを開発するために、ロシアの異なる地域のジャガイモ塊茎から単離された45C.coccodes株のグリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列が決定された。
得られた結果とGenBankデータベースで利用可能な他の種の類似配列の分析に基づいて、種特異的プライマーとC.coccodesのプローブが設計されました。 作成したテストシステムの特異性を確認するために、トマトとジャガイモの植物(Fusarium oxysporum、F。verticillium、Phomopsis phaseoli、Alternaria alternata、Helminthosporium solani、Colletotrichum coccodes)に関連する15種類の寄生虫および腐敗性真菌の純粋な培養物から単離したDNAを使用してPCRを行いました。 Phellinus ferrugineovelutinus、Stemphylium vesicarium、Helminthosporium solani、Phomopsis phaseoli、Neonectria radicicola、Rhizoctonia solani、Penicillium sp。、Cladosporium fulvum、C。cladosporioides)。 Colletotrichum coccodes DNAの存在は、20〜27のしきい値サイクルで決定されましたが、他の種は40サイクル後に検出されたか、検出されませんでした。 このテストシステムにより、分析されたPCR混合物中の0.01 ng / mm3を超えるC.coccodesDNA濃度を確実に検出することができます。 開発された試験システムを使用して、真菌性疾患の症状を伴うトマトの葉および疾患の外部症状を伴わないジャガイモ塊茎におけるC.コココードの存在を調査した。 真菌感染症の症状のある葉は、クラスノダール地域の5つの異なる畑、塊茎から、コストロマ、モスクワ、カルーガ、ニジニーノヴゴロド地域の畑から集められました。 C. coccodesDNAを含むXNUMX枚のトマトの葉がクラスノダール地域で発見されました。 この病原体のDNAの有意な存在は、コストロマ、モスクワ、カルーガ地域で栽培された塊茎のXNUMXつのサンプルで検出されました。
導入
Colletotrichum属の真菌は、穀物、野菜、ハーブ、多年生の果物、ベリー植物に影響を与える危険な植物病原体です。 この属の遍在する種のXNUMXつ、Colletotrichum coccodes(Wallr)。
ヒューズは、炭疽病とジャガイモとトマトの黒い斑点の原因物質であり、ソラナ科の他の多くの植物の病気を引き起こします。 雑草(ディラード、1992年)。 C. coccodesは、植物のすべての地下部分、茎の基部、葉、および果実に感染します(Andrivon et al。、1998; Johnson、1994)。 感染したジャガイモ塊茎の皮には、はっきりとはっきりとした縁のある灰色の斑点の発達が観察され、その上に胞子形成と微小菌核の黒い点がはっきりと見えます。 保管中に、内容物が軟化した潰瘍が塊茎の果肉に形成される可能性があります。 病気は炭疽病期に入りますが、それは非常にまれです。
同時に、炭疽病(小さな黒い点のある皮膚潰瘍)の症状はトマト果実に典型的です。 葉の上では、C。coccodesの症状は暗褐色の斑点として現れ、通常は黄色の組織で縁取られています(Johnson、1994)。
塊茎の黒い斑点の発達はそれらの外観を台無しにします、そしてそれは洗浄された赤い皮のジャガイモを売るとき特に顕著です。 皮の剥離は、過剰な蒸発と貯蔵損失の増加につながります(Hunger、McIntyre、1979)。 他の植物器官への損傷は収量の損失につながり、それは開放地と閉鎖地の両方で認められた(Johnson、1994; Tsror et al。、1999)。 C. coccodesによって引き起こされる病気は、ロシアを含む世界のほぼすべてのジャガイモ生産地域で一般的です(Leesa、Hilton、2003; Belov et al、2018)。 C. coccodesに対する既存の殺菌剤の効果が不十分であり、耐性のある品種がないため、これらの疾患の管理は困難です(Read、Hide、1995)。
C. coccodesの接種物は、種子塊茎(Read、Hide、1988; Johnson et al。、1997)、トマト種子(Ben-Daniel et al。、2010)で存続し、土壌中、植物の残骸上で長期間生存することができます(Dillard、1990 ; Dillard、Cobb、1993)および雑草(Raid、Pennypacker、1987)。 多くの著者(Read、Hide、1988; Barkdoll、Davis、1992; Johnson et al。、1997; Dillard、Cobb、1993)は、ジャガイモとトマトの病気の発症は種子中の接種物の存在に大きく依存することを示しています。土。 したがって、病気による損失を最小限に抑えるために、種子材料、土壌、種子ポテト塊茎および貯蔵用に置かれたトマト種子中の真菌の増殖を(定量的に含む)診断する必要があります。 土壌および植物材料の形態学的診断は、微小菌核の存在によってのみ実行できますが、他の種類の真菌にも見られます。
塊茎の症状は、真菌Helminthosporiumsolaniによって引き起こされる銀色のかさぶたに非常に似ています。 ColletotrichumcoccodesとHelminthosporiumsolaniを純粋な培養物に分離することはかなり困難であり、栄養培地での成長が遅いために長い時間がかかります。 Colletotrichum coccodeをすばやく識別するには、機器の診断方法を使用する必要があります。 最も便利な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とその変更(リアルタイムPCR)です。 現在、英国の研究者によって開発されたrDNAのITS2002領域用のテストシステム(Cullen et al。、1)は、ヨーロッパと米国で使用されています。 その使用は、ロシアの分離株の分析で良い結果を示しています(Belov et al、2018)。 ただし、C。coccodesは非常に多様であり、単一のDNAシーケンスからの検出は偽陰性の結果につながる可能性があります。 より信頼性の高い診断を行うには、いくつかの種特異的DNA配列の分析が必要です。これに関連して、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の配列によってC.coccodesを識別できる独自のテストシステムを開発しました。
材料および方法
作成したテストシステムの有効性と特異性を評価するために、トマトの葉と果物、ジャガイモ塊茎の病気のサンプルから著者が分離した15種の真菌の純粋な培養物を使用しました(表1)。 隔離のために、真菌感染の症状を示す植物の器官を採取しました。茂みごとにXNUMXつの器官しか採取しませんでした。
皮をむいた塊茎のスライス、トマトの果実のスライス、および影響を受けた葉を両眼顕微鏡下に置き、その後、菌糸、胞子、または組織片を、鋭利な解剖針を備えたペトリ皿の寒天培地(麦汁寒天)に移した。 分離株は、4°Cで試験管内の寒天傾斜に保存されました。
(野外で)採取した直後の、分析を目的とした真菌性疾患の症状を伴うトマトの葉のサンプルを70%エチルアルコールに入れ、DNAが単離されるまで保存した。 ポテト塊茎は実験室に運ばれ、それらから剥がされ(2×1 cm片)、– 20°Сで凍結されました。 DNAが単離されるまで凍結保存。
DNA単離のための真菌の純粋な培養物は、液体エンドウ豆培地で成長させた。 真菌の菌糸を液体培地から取り出し、濾紙上で乾燥させ、液体窒素で凍結し、均質化し、CTAB緩衝液中でインキュベートし、クロロホルムで精製し、イソプロパノールと0.5M酢酸カリウムの混合物で沈殿させ、2%アルコールで70回洗浄した。 得られたDNAを脱イオン水に溶解し、–20°Сで保存しました(Kutuzova et al。、2017)。 DNA濃度は、Qubit 3.0(Qiagen、ドイツ)で二本鎖DNA用のHSDNA定量化キットを使用して測定しました。 アルコール化および凍結されたサンプルを液体窒素で粉砕し、次に上記のようにDNA抽出を行った(純粋な真菌培養物の菌糸について)。
表1.使用された菌株の起源
きのこ名 | 植物、器官 | 選択の場所 |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1、C。coccodes2、C。coccodes3、Ilyonectria crassa、Rhizoctonia solani | ジャガイモ塊茎 | コストロマ地域、第1フィールド世代のジャガイモ塊茎、栽培品種レッドスカーレット |
コレトトリカムコココード4 | じゃがいもの葉 | 担当者マリ・エル、ヨシュカル・オラ |
ヘルミントスポリウム・ソラニ | ジャガイモ塊茎 | マガダン地域、pos。 テント、ポテトチューバー |
クラドスポリウム・フルバム | トマトの葉 | モスクワ地方、大きな実のトマト |
アルテルナリアトマトフィラ | トマトフルーツ | 全ロシア植物保護研究所の菌学および植物病理学研究所のスタッフから引き渡された |
Fusarium verticillium、Phomopsisphaseoli、Alternaria alternata、Phellinus ferrugineovelutinus、Stemphylium vesicarium、Cladosporium cladosporioides、Acrodontium luzulae、Penicilliumsp。 | トマトフルーツ | Krasnodar Territory、Krymsky地区、グレードクリーム |
フザリウム·オキシスポラム | 小麦の根 | モスクワ地方。 |
PCRは、DTprimeアンプ(DNA-Technology)で実行されました。 PCRには、元のプライマーと、グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の種特異的領域のプローブを使用しました。フォワードプライマーCoc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA、リバースプライマーCoc280gdr –TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1。 プライマーは213bpの領域を増幅します。
反応には、50 ngの全DNA(葉と塊茎の分析)と10 ng(真菌の純粋な培養物のDNAの分析)が必要でした。 反応混合物(35μl)はパラフィン層によって20つの部分に分離されました:下の部分(2μl)は10μlの750×反応バッファー(8.8 mM Tris-HCl、pH 200; 4 mM(NH2)4SO25; 2 mM MgCl0.1; 20%Tween- 0.5)、7 mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸、4 pmolの各プライマー、および1pmolの加水分解性蛍光プローブ。 上の方には、10μlの1×PCRバッファーとXNUMXUのTaqポリメラーゼが含まれていました。
混合物をパラフィンで分離すると、チューブを5°Cの温度で長期間保存し、10°Cを超える温度で80分間加熱した後、PCRのホットスタートを提供できます。 PCRは、次のプログラムに従って実行されました。94.0°C-90秒(1サイクル)。 94.0°C-30秒; 64.0°C-15秒(5サイクル); 94.0°C-10秒; 64.0°C-15秒(45サイクル); 10.0°C-保管。
結果と考察
グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列は、ロシアのさまざまな地域で葉、茎、ジャガイモ塊茎およびトマト果実(Kutuzova、45)から分離された2018株で決定されました。 すべての菌株の研究された配列は、2つのヌクレオチドが異なる496634つのグループに分けられました。 KY496635およびKYXNUMXの番号で両方のグループの代表のヌクレオチド配列はGenBankに寄託されています。
プライマーcoc70gdf、coc280gdr、およびそれらに基づいて設計されたcocgdzプローブは、BLASTプログラムを使用してチェックされました(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)Colletotrichum属の種およびGenBankデータベースで利用可能な他の生物のグリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のすべての配列。
プライマーおよびプローブと高度に相同な他の生物のDNA領域は見つかりませんでした。
テストシステムの感度は、C。coccodesDNA、炭疽病に感染したジャガイモの葉からのDNA(2017年にMari Elで収集、Red Scarlett品種)、およびブラックスポットの影響を受けた塊茎の皮(Kostroma地域で収集、さまざまなレッドスカーレット、表2)。 塊茎およびジャガイモの葉におけるDNAの存在を確認するために、C。coccodes株をそれらから純粋な培養物に単離した。
テストシステムの感度分析の結果は、PCR混合物の総含有量が0.05 ngを超える場合、サンプル中のC. coccodesDNAの存在を正常に診断するために使用できることを示しています。 0.131つのsclerotiaには平均0.04ngが含まれ、2002つの胞子には約2002 ngのDNAが含まれるため、これは検出には十分です(Cullen et al。、34)。 英国のグループによって開発されたテストシステム(Cullen et al。、0.05)は、同様の感度を示しました(37 ng DNAでしきい値サイクル0.005、XNUMX ngでXNUMX)。
すべての場合にC.coccodesを含む天然サンプルの分析により、サンプル中のC. coccodeの存在を確実に明らかにすることができました(表2)。 提案されたDNA単離法は、天然植物サンプルの分析にも適用可能でした。
表2.リアルタイムPCR用のColletotrichumココードを識別するために提案されたテストシステムの感度の決定
サンプル | サンプル中のDNA量*、ng | しきい値サイクル | C.coccodesの検出 |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
チューバーピール1 | 50 | 32 | + |
チューバーピール2 | 50 | 30 | + |
チューバーピール3 | 50 | 31.5 | + |
ポテトの葉 | 50 | 29.5 | + |
注意。 * PCR製品の混合物。
テストシステムの特異性は、15種の真菌から抽出されたDNAサンプルでテストされました。 真菌のすべての株は、トマト、ジャガイモ塊茎の影響を受けた健康な果物と葉から著者によって分離されました。 1つの株が小麦の根から分離されました(表XNUMX)。 果実の表面から分離されたものの中には、トマトに病原性のない種があります(例えば、Phellinusferrugineovelutinus)。
研究によると、C。coccodesDNAは20〜27のしきい値サイクルで検出されましたが、他の真菌種は検出されなかったか、サイクル40後に信号を発しました。これは、非特異的なノイズ効果に起因する可能性があります(表3)。
表3.さまざまな種類のキノコのテストシステムの確認
きのこ名 | しきい値サイクル |
コレトトリカムコココード 1 | 20.9 |
C.コッコーズ 2 | 22.6 |
C.コッコーズ 3 | 23 |
C.コッコーズ 4 | 22 |
フザリウム·オキシスポラム | > 40 |
F.バーティシリウム | > 40 |
リゾクトニアソラニ | > 40 |
ホモプシス・ファセオリ | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A.トマトフィラ | > 40 |
ヘルミントスポリウム・ソラニ | > 40 |
メシマコブ | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
イリオネクトリア・クラッサ | > 40 |
クラドスポリウム・クラドスポリオイデス | > 40 |
C.フルバム | > 40 |
アクロドンチウム ルズラエ | > 40 |
ペニシリウム エスピー。 | > 40 |
注意。 *すべてのサンプルのDNA量は10ngでした。
開発されたテストシステムは、壊死栄養性病原体の症状を伴うトマトの葉のサンプル中のC. coccodesと、目に見える症状のないシードポテト塊茎を識別するために使用されました。 研究のために、Kostroma、Moscow、Kaluga、NizhnyNovgorod地域で栽培されたさまざまな品種の種子塊茎を採取しました。 C. coccodes DNAの存在はサンプルで有意であると見なされ、その分析ではしきい値サイクルは35を超えませんでした。このしきい値は、0.05ngのC.coccodes DNA(しきい値サイクル33.5、表2)の信頼できる測定とその事実に基づいて選択されました。 40を超えるしきい値サイクルでは、他のいくつかの種類の真菌の非特異的DNAが診断されました。 このアプローチでは、C。coccodesDNAの有意な存在が、Kostroma、Moscow、Kaluga地域で栽培された塊茎の5つのサンプルと、Krasnodar地域のYeisk地区の4つのトマトの葉で検出されました(表5、XNUMX)。
表4.ジャガイモ塊茎におけるColletotrichumココードの検出*
サンプル番号 | 様々なジャガイモ | 成長の場 | C.coccodesの検出 | しきい値サイクル |
---|---|---|---|---|
1 | レッドスカーレット | コストロマ地域 | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | サンテ | モスクワ地方。 | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky早期 | モスクワ地方。 | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | モリー | カルーガ地域。 | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | ファンタジー | カルーガ地域。 | - | |
15 | ガラ | ニジニノヴゴロド地域。 | - | |
16 | - |
注意。 *すべてのサンプルのDNA量は50ngでした。
表5.トマトの葉でのColletotrichumココードの検出*
サンプル番号 | 成長の場 | C.coccodesの検出 | しきい値サイクル |
---|---|---|---|
1 | クリミア地区クラスノダール準州 | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | イェイスク地区クラスノダール地域 | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
*すべてのサンプルのDNA量は50ngでした。
私たちが作成したテストシステムは、感度と特異性において英国の研究者によって開発されたもの(Cullen et al。、2002)に劣らず、植物サンプルの分析に適しています。 種子塊茎の分析へのその応用は、損傷の外部兆候なしに塊茎内のC. coccodes DNAを識別し、葉の感染を首尾よく分析することを可能にしました。
現在まで、ロシアではC.coccodesの蔓延に関するジャガイモ塊茎の分析は行われていません。 私たちの最初の研究では、ロシア連邦のさまざまな地域で栽培された16のテスト済み種子塊茎のうち、5つにC.coccodeが含まれていることが示されました。 これは、ジャガイモ塊茎の黒い斑点がロシアで一般的なジャガイモ病であり、ジャガイモ作物の量と質を低下させるその役割が過小評価されていることを示しています。
トマトの葉の分析により、クラスノダール地域のイェイスク地区の2002枚の葉にC. coccodesDNAが有意に存在することが明らかになりました。 以前、英国のテストシステムを使用してロシア南部のトマト畑を調べたところ(Cullen et al。、2018)、C。coccodesを含む葉が見つかり、一部の畑ではC. coccodesに感染した葉の割合が高いことがわかりました(Belov et al。、 XNUMX)。 モスクワ地方のクラスノダールとプリモルスキーの領土で、トマトの果実を見つけ、そこからC.coccodesの純粋な培養物を分離することができました。 C. coccodesは、現在信じられているよりもはるかにロシアのトマトに蔓延している可能性があり、その有害性も過小評価されています。
したがって、今日まで、ジャガイモとトマトにおけるC.coccodesの広範な分布に関する十分な情報が蓄積されてきました。
ジャガイモとトマトの病気の発症におけるこの真菌の役割をよりよく理解するには、ロシアでのその蔓延を監視し、土壌と種子の感染の役割、および貯蔵中の損失におけるブラックスポットの役割を研究する必要があります。 PCR診断を使用すると、この作業が大幅に容易になり、両方のテストシステムを同時に使用すると、分析の精度が大幅に向上します。
この作品は、ロシア科学財団の助成金番号18-76-00009によってサポートされていました。
この記事は、ジャーナル「Mycology and Phytopathology」(第54巻、第1号、2020年)に掲載されました。