食べる。 Chudinov、V.A。 プラトノフ、A.V。 アレクサンドロワ、S.N。 エランスキー
最近、ascomycete菌Ilyonectriacrassaがジャガイモ塊茎に感染することができることが示されました。 この研究は、ジャガイモから分離されたI.crassa株の生物学的特性といくつかの殺菌剤に対する耐性を分析した最初の研究です。 「ポテト」株の種特異的領域の配列は、水仙、高麗人参、アスペン、ブナ、ユリの球根、チューリップの葉の根から分離された真菌について以前に得られたものと一致しました。 どうやら、多くの野生および庭の植物はI.crassaの保護区である可能性があります。 調査した菌株はトマトとジャガイモのスライスに感染しましたが、トマトの果実全体と無傷のジャガイモの塊茎には感染しませんでした。 これは、I.crassaが傷の寄生虫であることを示しています。 栄養培地でのフルジオキソニル、ジフェノコナゾールおよびアゾキシストロビンに対する耐性の評価は、これらの薬剤の高い有効性を示した。
EC50指標(殺菌剤の濃度は、殺菌剤対照と比較してコロニーの放射状成長の速度の2倍遅くなります)は0.4に等しかった。 それぞれ7.4および4mg / l。 ジャガイモ塊茎の植物病理学的評価および植物保護手段の開発において、I.crassaによって引き起こされる疾患の発症の可能性を考慮に入れるべきである。
植物病原性微生物の発生は、ジャガイモの成長と貯蔵のすべての段階で高い損失をもたらします。 保護措置を計画する際には、原則として、アルテルナリア属、フサリウム属、フォマ属、ヘルミントスポリウム属、コレトトリカム属、フィトフトラ属などのよく知られた病原体が考慮されます。しかし、近年、ジャガイモに新しい植物病原性微生物が出現するという報告が増えています。 それらの生物学は十分に研究されておらず、それらに関連してジャガイモに使用される殺菌剤の有効性は不明であり、診断方法は開発されていません。 大量開発により、それらはジャガイモ作物に重大な損害を与える可能性があります。 これらの微生物の2019つは、アスコミ科菌のIlyonectria crassa(Wollenw。)A。Cabral&Crousであり、著者によってジャガイモ塊茎で最初に発見されました(Chudinova et al。、XNUMX)。
この作品は、ジャガイモ塊茎から分離されたI.crassa株の分析結果を示しています。 I. crassaのコロニーの形態と菌核構造、種特異的DNA領域のヌクレオチド配列、ジャガイモとトマトに対する毒性、およびいくつかの一般的な殺菌剤に対する耐性が研究されました。
材料および方法
Kostroma地域で栽培された影響を受けたジャガイモ塊茎から18年に分離されたI.crassa2KSuPT2018株を使用しました。 塊茎は、薄茶色の菌糸で覆われた空洞を備えた乾性腐敗型の影響を受けた。 無菌の解剖針を使用して、真菌の菌糸を寒天培地(ビール麦汁10%、寒天1.5%、ペニシリン1000U / ml)を入れたペトリ皿に移した。 プレートを暗所で24℃でインキュベートした。
ICC2500HDデジタルカメラを備えたLeicaDM50光学顕微鏡と、IC80HDデジタルカメラを備えたLeica M80両眼顕微鏡(Leica Microsystems、Germany)を使用して、胞子と胞子器官のサイズと形態を撮影、評価しました。
DNAを単離するために、真菌菌糸を液体エンドウ豆培地で増殖させ、次に液体窒素で凍結し、均質化し、CTABバッファーでインキュベートし、クロロホルムで精製し、2%アルコールで70回洗浄した。
DNA抽出法については、Kutuzova etal。の記事に詳しく説明されています。 (2017)。
分子法によって種を決定し、他の既知のI. crassa株と比較するために、種特異的DNA領域の増幅を可能にするプライマーでPCRを実行しました:ITS1-5,8S-ITS2(プライマーITS5 / ITS4、White et al。、1990)、遺伝子領域b -チューブリン(Bt2a / Bt2b、Glass、Donaldson、1995)および翻訳伸長係数1α(tef1α)(プライマーEF1-728F / EF1-986R、CarboneおよびKohn、1999)。 Evrogen CleanUpキットを使用して、目的の長さのアンプリコンをゲルから抽出しました。 増幅された領域は、Applied Biosystems 3.1 xl自動シーケンサー(Applied Biosystems、CA、USA)でBigDye®Terminatorv3730Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems、CA、USA)を使用してシーケンスされました。 得られたヌクレオチド配列を使用して、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のGenBankデータベースで一致するものを検索しました。 系統発生学的分析は、MEGA 6プログラムを使用して実行されました(Tamura et al。、2013)。
毒性の測定は、大きな実をつけたトマト(品種Dubrava)とジャガイモ塊茎(品種Gala)の全緑色の果実で行われました。 さらに、損傷した果物と塊茎への損傷をシミュレートするために、同じ果物と塊茎のスライスを使用しました。 塊茎のスライスは、底に湿った濾紙を備えたペトリ皿である湿ったチャンバーに置かれた。 スライドが紙の上に置かれ、その上に塊茎または果物のスライスが置かれました。 塊茎と果物全体も、底に湿った濾紙が付いた容器に入れられました。 スライスの中央(または塊茎または果実の無傷の表面)に、麦汁寒天上で5日間成長させた後、真菌性ハイファを含む寒天(5×5 mm)を置きました。
殺菌剤に対する真菌株の耐性の評価は、寒天栄養培地上の実験室条件で実施された。 殺真菌剤マキシム、KS(有効成分フルジオキソニル、25 g / l)、クアドリス、KS(アゾキシストロビン250 g / l)、スコア、EC(ジフェノコナゾール250 g / l)に対する感受性を研究しました(州のカタログ...、2020)。 評価は、活性物質0.1の濃度で研究対象の薬剤を添加した麦汁寒天培地上のペトリ皿で実施されました。 1; 10 ppm(mg / L)(フルジオキソニルおよびジフェノコナゾールの場合)、1; 十; 10 ppm(アゾキシストロビンの場合)および殺菌剤を含まない培地(対照)。 溶融した培地に殺菌剤を加え、100℃の培地に冷却した後、培地をペトリ皿に注いだ。 ペトリ皿の中央に真菌菌を含む寒天ブロックを置き、暗所で60℃の温度で培養した。 インキュベーションの24日後、コロニーの直径を7つの相互に垂直な方向で測定しました。 各コロニーの測定結果を平均した。 実験は50回行った。 分析の結果に基づいて、殺真菌剤の濃度に等しいEC2が計算され、殺真菌剤対照と比較してコロニーの放射状成長速度が半分になりました。
結果と考察
麦汁寒天のペトリ皿では、真菌は白い綿状の菌糸でコロニーを形成しました。 菌糸の下の培地は赤褐色に変わった。 培地が乾くと、真菌は小さな胞子嚢の単一および凝集した分生子に27.2種類の胞子を形成しました。 マクロコニディアは細長く、円筒形で、23.2〜32.2セプタ、平均長さ4.9 µm、値の範囲は1〜14.3 µm、幅は最大10.3 µmです(図18.1)。 微小分生子の平均の長さは4.0µmで、値の範囲は2012〜XNUMX µm、幅は最大XNUMX µmです。 すべてのマクロおよびミクロ形態学的特徴は、Ilyonectria crassa種のバリエーションの範囲に適合します(Cabral et al。、XNUMX)。
種特異的DNA領域(ITS、b-チューブリン、TEF1α)の配列は、以前に研究したI. crassa株の配列と完全に一致しました(Chudinova et al。、2019、表1)。 他の地域でのI.crassaの蔓延を研究し、影響を受けた培養物のスペクトルを分析するために、GenBankデータベースの類似のDNA配列を分析しました(表1)。 オーバーラップは86から100%でした。 「ポテト」I.クラッサ株の1つのDNA領域すべての配列は、オランダのユリの球根と水仙の根、およびカナダのジンセンの根から分離された株の配列と同一でした。 オープンデータベースでXNUMXつの分析された類似のシーケンスを持つ他のI.crassa株を見つけることができませんでした。 しかし、寄託されたITSおよびb-チューブリン配列の分析は、英国のチューリップの葉にI.crassaが存在することを示しました。 カナダのポプラの根とイタリアのブナの根、サウジアラビアのジャガイモの塊茎の菌叢の分析で、同様のITS配列を持つ真菌が同定されました(表XNUMX)。 この研究の結果は、I。crassaが世界的に分布しており、さまざまな植物種に感染できることを示しています。
5日目にトマトとジャガイモのスライスの病原性を測定したところ、病変の直径は1.5cmに達した。調査した菌株はトマト果実全体と無傷のジャガイモ塊茎に感染しなかった。 しかし、sepalsはトマトに影響を及ぼしました。 汚染の可能性を排除するために、ジャガイモ塊茎スライス上で発達した菌糸からの真菌分離株を純粋な培養物に単離した。 それは親株と完全に同一でした。 どうやら、I.crassaは傷の寄生虫です。
殺真菌剤による種塊茎の植え付け前処理は、成長期の植物の病気の発症を減らします。 効果的な殺菌剤を選択するには、どれがI.сrassaに対して効果的であるかを評価することが重要です。 この研究では、殺菌剤の広範な活性物質であるフルジオキソニル、アゾキシストロビン、ジフェノコナゾールを研究しました。 フルジオキソニルは、植える前に種子や種子塊茎をドレッシングするために使用されるいくつかの混合物に含まれています。 Fludioxonil(Maxim)は、保管前に種子塊茎を治療するためにも使用されます。 ジフェノコナゾールとアゾキシストロビンは、種子材料の処理に使用される多くの製剤や、植物植物の処理を目的とした製剤にも含まれています(州のカタログ...、2020年)。
I. crassaの成長速度は、フルジオキソニル(EC2 = 50 ppm)、アゾキシストロビン(EC0.4 = 50 ppm)、およびジフェノコナゾール(EC4 = 50 ppm)のさまざまな濃度の活性物質を含む培地(図7.4)で研究されました(表2)。 これらの製剤は、EC50が塊茎の治療に使用される作動液中の製剤の推奨濃度よりも大幅に低いため、I。クラッサに対して非常に効果的であると見なすことができます。 州のカタログ...(2020)によると、ジャガイモ塊茎を治療するための液体中のフルジオキソニルの濃度は500〜1000 ppm、アゾキシストロビン(溝の底を治療するための液体中)-3750-9375 ppm、ジフェノコナゾール(植物植物を治療するための液体中)-187.5– 625ppm。
表1.Genbankデータベースで入手可能な18KSuPT2株とIlyonectriacrassa株の種特異的配列の配列類似性
株 | ホストプラント、排泄場所 | GenBankに寄託されたシーケンス番号、類似性のパーセンテージ | リンク | ||
ITS | β-チューブリン | TEF1α | |||
17KSPT1および18KSuPT2 | ポテト塊茎、コストロマ地域 | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al。、2019、この作品 |
CBS 158/31 | 水仙のルーツ、オランダ | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al。、2012 |
CBS 139/30 | リリーバルブ、オランダ | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | ギンセンルート、カナダ | アヤックス 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | チューリップの葉、英国 | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | デントン、デントン、2014年 |
MT294410 | アスペンのルーツ、カナダ | MT294410 100 | ND | ND | ラムズフィールド他、2020年 |
ER1937 | ブナ、イタリア | KR019363 99.65 | ND | ND | ティザニ、ヘギ、モッタ。 直接提出 |
カウフ19 | ポテト塊茎、サウジアラビア | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari、Gherbawy、2013年 |
ND =デポジットされていません
表2.殺菌剤に対するIlyonectriacrassaの耐性
(活性物質) | EC50、ppm | ||||
3日 | 5日 | 7日 | |||
コントロール | 17 2± | 33 5± | 47 3± | ||
Quadris、KS(fsoxystrobin) | 18 1± | 34 2± | 48 2± | ||
11 1± | 11 1± | 12 1± | |||
11 1± | 11 1± | 12 1± | |||
マキシム、KS(フルジオキソニル) | 16 1± | 28 2± | 48 2± | ||
7 1± | 13 3± | 19 4± | |||
5 1± | 12 1± | 17 5± | |||
Skor、EC(ジフェノコナゾール) | 18 1± | 35 2± | 48 1± | ||
11 1± | 24 3± | 35 4± | |||
11 1± | 13 1± | 17 3± |
私たちの研究では、I。crassa株は、KostromaおよびMoscow(Chudinova et al。、2019)地域のジャガイモ塊茎から分離されました。 サウジアラビアのジャガイモ塊茎の菌叢を分析したところ、ITS配列がI. crassaと同一の真菌株の割合が高いことが明らかになりました(Gashgari and Gherbawy、2013)。 どうやら、I.crassaは見た目ほどポテトでは珍しいことではありません。 私たちの実験は、真菌が損傷したトマト果実に感染する可能性があることを示しました。 I. crassaは、土壌中で腐敗的に発達するだけでなく(Moll et al。、2016)、水仙、ユリ、ジンセン、アスペン、ブナなどの分類学的に離れた植物でさえ、さまざまな植物に影響を与えることができることが文献から知られています(表1)。 XNUMX)。 どうやら、多くの野生および庭の植物はI.crassaの保護区である可能性があります。 上記は、保護対策を開発する際に、この真菌でジャガイモ塊茎に影響を与える可能性を考慮する必要があることを示しています。 フルジオキソニル、アゾキシストロビンおよびジフェノコナゾールを含むジャガイモ塊茎の治療のための広範な製剤は、I.crassaに対して高い殺真菌効果を示した。
この作品は、ロシア基礎研究財団(助成金番号20-016-00139)によってサポートされていました。
この記事は、ジャーナル「Plant Protection Bulletin」、2020、103(3)に掲載されました。